1、如何验证抗在CUT&RUN中起作用？

对于CUT＆RUN实验，验证数据可以包括例如 Tapestation或Bionalyzer图显示大小分布，qPCR数据显示靶标富集。由于CUT&RUN的样本量较低，获得的DNA也相对较少，对于低丰度的靶蛋白，浓度通常太低而无法使用荧光测定法或毛细管电泳测量，所以需要选择高灵敏度的Qubit 或 Nanoｄrop fluorometer以及Tapestation或Bionalyzer。如果获得的DNA＜50bp ，PCR扩增是无法进行的。旦产生了测序文库并进行了测序图测序，就可以读取并验证读取在已知结合位点的积累。

2、实验中是否需要使用二抗？

二抗的使用取决于抗体和pA/G-MNase融合蛋白的宿主和亚型，对于pA / G-MNase结合，可能是需要的。蛋白A对所有兔IgG抗体具有良好的高亲和力，但对大鼠，山羊和绵羊IgG同种型抗体以及某些小鼠IgG抗体亚类（尤其是IgG1）具有低亲和力。另方面，蛋白G与小鼠，山羊，绵羊和大多数大鼠IgG的Fc区结合良好。但是，它对兔IgG的亲和力低于蛋白A。当使用我们改进后的CUT＆RUN 方案时通常不需要二抗。原始的方案则需要二抗来确保融合蛋白与抗体的有效结合。

3、CUN&RUN是否可改造适用于RIP-seq?

改善CUT&RUN的操作步骤作用在RNA上，以作为RIP-seq的替代方案是有可能可以实现的。细胞质中的RNA如果缺乏5‘cap和3‘poly-A则易被降解，因此建议选用细胞核作为样本。由于核被膜不含胆固醇，所以不需要使用dignitonin。分离出来的细胞核可通过核被膜上的糖蛋白固定在ConA磁珠上，再加入抗体识别目的蛋白，然后加入pA/G-MNase靶向到抗体上，从而切割RNA。zui后将RNA分离出来转录成cDNA并进行测序和定位。

艾美捷作为表观遗传域业的解决方案供应商，推荐EpiGentek的EpiNext CUT&RUN Fast Kit，cat#：P-2028,该试剂盒从低输入提供无超声破碎，以可靠地识别真正的目标蛋白质富集区域并实现高分辨率定位。可满足您快速富集蛋白质结合的DNA并绘制全基因组蛋白质/DNA相互作用的图谱的需求。

来源：https://www.amyjet.com/featured/cutrun-2.shtml