人脱氧胶原吡啶交联（DPD）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!
预期应用
ELISA 法定量测定人血清、血浆、组织匀浆或其它相关生物液体中脱氧胶原吡啶交联（DPD）含量。
实验原理
用纯化的DPD 抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的DPD 抗体、HRP
标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作
用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的DPD 呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD
值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1、酶标板：一块（96 孔）
2、标准品（冻干品）： 2 瓶，请临用前15 分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置
大约10 分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为20 ng/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在
板中进行倍比稀释），分别配制成20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312
ng/ml，样品稀释液直接作为空白孔0 ng/ml。如配制10 ng/ml 标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）20
ng/ml 的上述标准品加入含有0.5ml 样品稀释液的Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、样品稀释液：1×20ml。
4、检测稀释液A：1×10ml。
5、检测稀释液B：1×10ml。
6、检测溶液A：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液A 1:100 稀释（如：10 检测溶液A / 990
检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100 /孔），实际配制时
应多配制0.1-0.2ml。
7、检测溶液B：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B 1:100 稀释。稀释方法同检测溶液A。
8、底物溶液：1×10ml/瓶。
9、浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25 倍。
10、终止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5 张
12、使用说明书：1 份
自备物品
1、酶标仪（建议仪器使用前提前预热）
2、微量加液器及吸头，EP 管
3、蒸馏水或去离子水，滤纸
标本的采集及保存
1、血清：全血标本请于室温放置2 小时或4 过夜后于1000 g 离心20 分钟，取上清即可检测，或将上清
置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。
2、血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于1000 g 离心15 分钟，取上清即可检测，
或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。
3、组织匀浆：将动物的组织标本先用PBS 洗涤，去除多余血液，匀浆化后放在20ml PBS 中于-20℃放置
过夜，第二天，经过二次反复冻融破膜，将匀浆物5000x g 离心5 分钟，取上清即可检测。
4、其它生物标本：请1000 g 离心20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应
避免反复冻融。
注：以上标本均应密封保存，4 保存应小于1 周，-20 不应超过1 个月，-80 不应超过2 个月；标本溶血
会影响*后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37 溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混
匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品
符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 ，余孔分别加标准品或待测
样品100 ，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板
加上盖或覆膜，37 温育2 小时。为保证实验结果有效
性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A 工作液100 （临用前配制），酶标板加上覆膜，37 温
育1 小时。
3、弃去孔内液体，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分钟，大约400 /每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体
拍干）。
4、每孔加检测溶液B 工作液（临用前配制）100 ，加上覆膜，37 温育1 小时。
5、弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，方法同步骤3。
6、每孔加底物溶液90 ，酶标板加上覆膜37 避光显色（反应时间控制在15-30 分钟，当标准孔的前3-4
孔有明显的梯度蓝色，后3-4 孔梯度不明显时，即可终止）。
7、每孔加终止溶液50 ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入
顺序相同。
8、立即用酶标仪在450nm 波长测量各孔的光密度（ 值）。
注：
1、试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请
使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2、加样：加样或加试剂时，个孔与*后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预
温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）
控制在10 分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3、温育：为防止样品蒸发，实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发；洗板后应尽
快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4、洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要
消除板底残留的液体和手指印，避免影响*后的酶标仪读数。
5、试剂配制：Detection A 及Detection B 在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液
体沉积到管底。标准品、检测溶液A 工作液、检测溶液B 工作液请依据所需的量配制使用，并使用相应的
稀释液配制，不能混淆。请精确配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取检测溶液A 时，一次不
要小于10 ），以避免由于不准确稀释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A
工作液、检测溶液B 工作液。
6、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10 分钟），如颜色较深，请
提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7、底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
洗板方法
1、手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml 注入孔内，浸泡1-2 分钟，吸去（不可触及板壁）或
甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；根据需要，重复此过程数次。
2、自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的人脱氧胶原吡啶交联（DPD），且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
各标准品及样本值扣除空白孔值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品
的浓度为纵坐标（对数坐标）， 值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业
制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3，根据样品值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍
数；或用标准物的浓度与值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的值代入方程式，计算出样品浓度，
再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
说明
1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到
微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本/ 标准品，酶结合物或底物时，
个孔与*后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响
到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。
3. 试剂盒保存：部分试剂保存于-20℃，部分试剂保存于2-8℃，具体以标签上的标示为准。
4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
6. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
7. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
8. 有效期：6 个月
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酶联免疫试剂盒属我公司专业供应，品质保障，免费代测，公司主要经营生化产品：试剂盒：国产ELISA试剂盒、进口ELISA试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、免疫组化试剂盒、放免试剂盒、分子生物学试剂盒、金标检测试剂盒、Omega试剂盒、细胞凋亡试剂盒、生化试剂盒。
