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JM109化学感受态细胞的操作方法
点击次数：338 发布时间：2018/7/31
远慕生物生产的JM109感受态细胞是采用大肠杆菌JM109菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化使用pUC19质粒检测，转化效率可达108，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。
基因型：recA supE44 endA1 hsdR17 gyrA96relA1 thi Δ(lac-proAB) F’[traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]
特 点：一种琥珀抑制型F’重组缺陷菌株。支持M13噬菌体载体的生长，对转染的DNA有修饰作用，但无限制作用。该菌株中的F’带有lacZΔM15，后者使得与在λZAP中编码的β-半乳糖 苷酶氨基端进行α-互补，可用于蓝白斑筛选。
操作方法：（以下各步骤均为无菌操作）
1、将感受态细胞置于冰上融化，以下实验以100ul感受态细胞为例。
2、向感受态细胞悬液中加入需转化的目的DNA，注意目的DNA的体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴放置30分钟。
3、将离心管置于42℃水浴中放置60-90秒，然后快速转移到冰浴中放置2-3分钟，注意不要摇动离心管。
4、向离心管中加入500ul无菌无抗的SOC或LB培养基，37℃ 180rpm振荡培养1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5、取适量已转化的感受态细胞涂布含相应抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培养12-16小时。涂布用量可根据具体实验来调整，如转化的DNA总量较多，可取100ul左右转化产物涂板；反之，如果转化的DNA总量较少，可取200-300ul的转化产物涂板。过多菌液可以抑制细菌生长。如果预计的克隆较少，可通过离心后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的平板。
注意事项：
1、收到感受态细胞应保存在-70℃，不可反复冻融，否则其转化效率将会降低。
2、实验过程中应严格无菌操作，防止其它DNA的污染，避免为以后的筛选、鉴定带来影响。
3、转化时，转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分。
4、转化率的计算：转化率＝产生菌落的总数/铺板DNA总量
5、为防止转化实验不成功，可以保留部分连接产物，以重新转化，将损失将到。
基因型：recA supE44 endA1 hsdR17 gyrA96relA1 thi Δ(lac-proAB) F’[traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]
特 点：一种琥珀抑制型F’重组缺陷菌株。支持M13噬菌体载体的生长，对转染的DNA有修饰作用，但无限制作用。该菌株中的F’带有lacZΔM15，后者使得与在λZAP中编码的β-半乳糖 苷酶氨基端进行α-互补，可用于蓝白斑筛选。
操作方法：（以下各步骤均为无菌操作）
1、将感受态细胞置于冰上融化，以下实验以100ul感受态细胞为例。
2、向感受态细胞悬液中加入需转化的目的DNA，注意目的DNA的体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴放置30分钟。
3、将离心管置于42℃水浴中放置60-90秒，然后快速转移到冰浴中放置2-3分钟，注意不要摇动离心管。
4、向离心管中加入500ul无菌无抗的SOC或LB培养基，37℃ 180rpm振荡培养1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5、取适量已转化的感受态细胞涂布含相应抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培养12-16小时。涂布用量可根据具体实验来调整，如转化的DNA总量较多，可取100ul左右转化产物涂板；反之，如果转化的DNA总量较少，可取200-300ul的转化产物涂板。过多菌液可以抑制细菌生长。如果预计的克隆较少，可通过离心后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的平板。
注意事项：
1、收到感受态细胞应保存在-70℃，不可反复冻融，否则其转化效率将会降低。
2、实验过程中应严格无菌操作，防止其它DNA的污染，避免为以后的筛选、鉴定带来影响。
3、转化时，转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分。
4、转化率的计算：转化率＝产生菌落的总数/铺板DNA总量
5、为防止转化实验不成功，可以保留部分连接产物，以重新转化，将损失将到。
