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干货来袭：ELISA实验常见问题
ELISA以灵敏度较高、特异性较好的特点在科研及临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，也会导致诸多问题。
1.标曲和样本都不显色
在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。
2.标曲有显色，样本却不显色
遇到这种情况，很多人觉得是试剂盒问题，这其实是一个误区。任何一种实验方法，都有其局限性，当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。如采用信号增强剂的高敏ELISA、ECL为底物的化学发光ELISA、采用荧光法检测的ELISA、结合PCR扩增的免疫PCR等等。
对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，甚至低于标准品浓度的S5点，虽然可以计算得到数值，但实际上这个数值的可信度已经降低了。而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。需要指出的是，国内某些所谓的高敏ELISA试剂盒，并没有采用信号增强剂的方法，而只是简单地提高了抗体浓度，较普通ELISA其灵敏度的提升有限。
还有人觉得，为什么用其它厂家的试剂盒可以测到样本值，而我们的就是测不到呢？这里就涉及到回收率这个概念了，详细的阐述下次有机会可以跟大家再聊一聊。简单来说，回收率就是样本的真实值和理论值之间的比值，优秀试剂盒的这个数值在80 – 120%之间。与回收率相关的试剂就是试剂盒中的标准品稀释液。筛选出合适的标准品稀释液，使目的蛋白含量接近的标准品和样本显色速度相似，那么计算得到的样本值也会比较接近真实值。要想测到样本值并不是很难，只要选择合适的标准品稀释液，压低标曲的本底，自然就会计算得到样本值，然而这样的样本值并不真实，对于科研来说没有太大的参考意义。
3.标曲不显色或者显色很弱，样本有显色
溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。标准品溶解时，需要涡旋震荡，以保证充分溶解。在做倍比稀释时，也要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定*佳。
4.标曲和样本都显色，但复孔的CV比较大
这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大。实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。个人的操作可以在空白板上练习移液动作，或者在几十个离心管中加入相同体积的水，通过电子天平称量，检验移液的精密度。同时还需练习加快加样速度，减少从个样本到*后一个样本加样时间过长导致的差异。
5.样本通过不同梯度稀释，计算得到的样本值差异比较大
有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后，计算得到的样本值之间差异较大，应该选择哪一个稀释倍数呢？
这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时，血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触，基质效应较明显。而经过稀释后，干扰因素也随之稀释，影响就会较小。当某两个梯度稀释后，计算得到的样本值接近时，我们就可以认为在该稀释梯度时，样本中的干扰因素影响较小，计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本，经过多倍稀释后，就更加测不到了，此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。
6.本底偏高，样本值都测不到
标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。
在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。
7.同一样本使用不同厂家的ELISA试剂盒检测，计算得到的样本值差异较大
这里涉及到另一个评估试剂盒性能的参数——校准。不同厂家采用的标准品可能有所不同，对其定量的方法和标准也不同，这就是企业标准。因此哪怕是同一个标准品，在不同厂家各自的实验条件下测定，结果可能也会差异很大。
因此，我们并不建议将不同厂家的结果进行对比，除非他们都是用标准品进行了校准。然而，并非所有蛋白都有标准品，因此使用不同厂家的产品计算的样本值差异较大的现象也在所难免。但都用同一厂家的试剂盒检测样本，那么结果还是可以进行统计学分析的。
在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。
