呕吐毒素高灵敏度检测试剂盒

RIDASCREEN? DON

酶联免疫分析快速定量测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素试剂盒德国R-Biopharm制造（中文翻译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准）。

RIDASCREEN? DON（产品编号：R5906）

1. 用途

   RIDASCREEN? DON采用竞争性的酶免疫分析法定量分析谷物、麦芽、啤酒及饲料中的呕吐毒素。试剂盒中含有酶免疫分析法所用的所有的试剂。试剂盒可以进行96个试验，包括标准。定量分析要求使用酶标板读数仪（含450nm波长）。

2. 概要

化学上称作脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol）的呕吐毒素（Vomitoxin）属于霉菌的单端孢菌素族，是由几种粉色镰刀霉真菌属产生的。玉米中*容易产生这种毒素，通常在欧洲及北美发现的三种毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇， 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，15脱氧雪腐镰刀菌烯醇。呕吐毒素在小麦、玉米以及稻米中的含量通常是mg/kg级的，由于他们高的细胞毒素及免疫抑制性质，对人类及动物构成了健康威胁。使用RIDASCREEN? DON 试剂盒可以检测谷物、玉米、大麦及饲料样品中的呕吐毒素，具有快速、准确的优点。

3.测定原理

测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对呕吐毒素小鼠IgG的捕捉抗体。加入呕吐毒素抗体，酶标记物，标准或样品溶液。游离呕吐毒素与酶标记物竞争呕吐毒素抗体，同时呕吐毒素抗体与捕捉抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将红色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色产生变化。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的浓度成反比。

4.  提供的试剂

每一个盒中的试剂足够进行91个测量（附加5个标准分析孔），盒中的材料如下：

1 X 96孔板（12条X 8孔，可以拆分为单孔）包被有捕捉抗体

5 X 标准液， 1.3ml/瓶， 为呕吐毒素标准溶液

标准液浓度为：0ppb；3.7ppb；11.1ppb；33.3ppb；100ppb 

1 X 呕吐毒素抗体溶液（6ml）小鼠单克隆………………黑色帽

1 X 酶标记的呕吐毒素（6ml）……………………………红色帽

1 X 基质/发色剂（12ml）………………………………白色滴瓶

1 X 反应停止液1M硫酸（12ml）………………………黄色滴瓶

1 X 洗液：10mM的磷酸盐缓冲液（PH 7.4）含有0.05%的Tween20

5.  需要的材料但盒中不提供

5.1设备

－－－－微孔板酶标仪（450nm）定量分析用

－－－－振荡器

－－－－粉碎机

－－－－50ul， 100ul， 1000ul微量加样器

－－－－100ml，1L量筒

－－－－50ml 漏斗及容量瓶

－－－－Whatman 或相当的滤纸

5.2 试剂

－－－－蒸馏水或去离子水

6. 操作者应该注意之事项

－－－－标准液含有呕吐毒素，应特别小心

－－－－使用过的玻璃容器及呕吐毒素溶液用pH 7的高氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜

－－－－反应停止液为1M硫酸，避免接触皮肤

－－－－不要使用过了有效日期的试剂盒， 稀释或搀杂使用会引起 灵敏度的降低

－－－－不要交换使用不同批号的盒中试剂

7. 储存条件

－－－－保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻

－－－－基质/发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下

－－－－将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封

8. 试剂变质的迹象

红色的基质/发色剂变为蓝色，表明基质/发色剂变质，应当弃之。

0标准的吸光度值小于0.6个单位（A450nm<0.6）时，表示试剂可能变质。

9. 样品处理

样品应当在暗处及冷藏保存

9.1谷物、麦芽、饲料

－－－－粉碎5g有代表性的样品与25ml蒸馏水混合

－－－－强力振荡3分钟

－－－－用Whatman No.1滤纸过滤

－－－－取50ul稀释液进行分析

根据需要可以增加样品量，但溶液的量也应相应增加（例如：样品50g+1000ml蒸馏水）

9.2 啤酒

－－－－取足够量的啤酒样品，除去过量的CO2

例如：搅拌啤酒样品，直至不产生明显的气泡。如果啤酒样品产生混浊，在除去过量的CO2之后，建议在样品检测之前，要进行无菌过滤。

9.3麦芽汁

－－－－取50μl样品到每个微孔板底

如果样品产生混浊，建议在样品检测之前，要进行无菌过滤。

10. 酶标免疫分析程序

10.1测定之前注意事项

1. 使用之前将所有试剂回升至室温（20-25℃）。

2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8 ℃。

3. 如果样品量大建议使用多通道移液器，在使用中不要让微孔干燥。

4. 在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。

5. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。

10.2包被有抗体的微孔板条

锡箔袋沿横向压皱外边打开。取出需用数量的微孔板及框架， 将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封， 保存于2-8℃。不要冷冻。

10.3标准液

呕吐毒素标准液为直接应用液。

10.4制备洗液缓冲液

方法一： 

试剂盒中装有磷酸盐小袋，每个小袋用1L蒸馏水溶解，溶解的洗液在4oC条件下可以保存4周。

方法二：

将磷酸盐每小袋只用100ml蒸馏水溶解，这样可以得到一个10倍的缓冲液浓缩液。这种溶液在室温（18-22°C）下，可保存8周。

使用时，1倍的浓缩液+9倍的蒸馏水稀释即可得到待用的洗涤缓冲液。

10.5测定程序（在18-24℃条件下操作）

1. 根据样品量将足够数量的孔条插入微孔架，记录样品及标准位置。

2. 加入50ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。

3. 加入50ul酶标记物到微孔底部（红色盖）。（注意移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免交叉污染。）

4. 加入50ul抗体溶液（黑色盖）到每一个微孔底部，充分混合，在室温（20-25°C）孵育30（+/-1）分钟。（注意此操作步骤要快，尽量保持前后孔孵育时间的一致，如果实验所用孔数量多，请用多通道移液器。移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体）。

5. 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将250ul洗涤缓冲液加入孔中。再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。（移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免污染洗涤液造成洗板不彻底。洗板后要立即进行下一步操作，避免板孔干躁造成重复性差）。

6. 加入 2滴（或100ul）基质/发色试剂（白色滴瓶）到微孔中， 充分混合并在室温（20-25℃）暗处孵育15（+/-0.5）分钟（注意此操作步骤要快，尽量保持前后孔孵育时间的一致，使用多通道移液器加液，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体）。

7. 加入 2滴（或100ul）反应停止液（黄色滴瓶）到微孔中混合好， （注意此操作步骤要快，如果实验所用孔数量多，请将所需数量的滴瓶中液体转移至V型试剂槽中，并用多通道移液器加液。）在450nm处测量吸光度值以空气为空白，必须在加入停止液后10分钟内读取光度值。

11. 结果

定量分析：所获得的标准和样品吸光度值除以个标准（0标准）的吸光度值再乘以100.因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。

标准的吸光度值（或样品）

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－x 100=   %吸光度值

0标准的吸光度值

计算的标准值绘成为一个对应呕吐毒素浓度（?g/kg）的半对数坐标系统曲线图， 相对应每一个样品的浓度（?g/kg）可以从标准曲线上读出。

请注意：

为了获得样品的实际浓度，从曲线上读出的数据，要乘以相应的稀释系数。

谷物、大麦、饲料………………………………5

啤酒………………………………………………1

麦芽汁……………………………………………1

12. 特异性

RIDASCREEN? DON试剂盒的特异性通过对相应的毒素进行交叉反应性分析而得到的。

交叉反应

13. 再现性

由三个不同的实验结果确定了室内精密度，图2显示出RIDASCREEN呕吐毒素试剂盒的精密度情况， 获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应呕吐毒素浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

14. 检测下限

谷物、大麦、饲料………………………………18.5?g/kg

啤酒………………………………………………3.7?g/kg

麦芽汁……………………………………………3.7?g/kg