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猪伪狂犬病毒抗原ELISA检测原理
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文件大小：32kb
上传时间：2016/6/14 10:06:18
文件类型：jpg
上 传 者：劲马免疫学第三方检测中心
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使用说明书 货号: SU-A50167
l 本试剂盒用于体外定性检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样 本中猪伪狂犬病毒抗原（PRV-Ag）。
l 有效期：6个月
l 保存条件：2-8℃
实验原理
试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被猪伪狂犬病毒抗原
（PRV-Ag）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、阴性和阳性对照、HRP标记的检测抗体， 经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作 用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的猪伪狂犬病毒抗原（PRV-Ag）呈正相关。用
酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），判定阴阳性。
样本处理及要求
1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测， 或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000g离心20分钟， 或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃ 或-80℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响*后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
需要而未提供的试剂和器材
1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱
4. 蒸馏水或去离子水
试剂盒组成
| 名称 | 96 孔配置 | 48 孔配置 | 备注 |
| 微孔酶标板 | 12 孔×8 条 | 12 孔×4 条 | 无 |
| 阴性对照 | 0.3mL*6 管 | 0.3mL*6 管 | 无 |
| 阳性对照 | 0.3mL*6 管 | 0.3mL*6 管 |
|
| 检测抗体-HRP | 10mL | 5mL | 无 |
| 20×洗涤缓冲液 | 25mL | 15mL | 按说明书进行稀释 |
| 底物 A | 6mL | 3mL | 无 |
| 底物 B | 6mL | 3mL | 无 |
| 终止液 | 6mL | 3mL | 无 |
| 封板膜 | 2 张 | 2 张 | 无 |
| 说明书 | 1 份 | 1 份 | 无 |
| 自封袋 | 1 个 | 1 个 | 无 |
注意事项
1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温 20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中 不要让微孔干燥掉。
3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。
4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6. 在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏 试剂盒中反应试剂的生物活性。
9. 不能使用过期产品。
10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
试剂准备
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
操作步骤
1. 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃。
2. 设置阴性对照孔、阳性对照孔和样本孔，阴性、阳新对照孔各加 50μL 对照品；
3. 样本孔中加入待测样本 50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体
100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸 上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入终止液 50μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。
实验结果计算
1. 阴性对照OD值：小于0.2。
2. 阳性对照OD值：大于0.8。
3、阳性判断（Cut-Off值）：阴性对照OD值+0.15，样本OD值大于阈值，判定为阳性，反之， 为阴性。
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