实验原理

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,此种结合不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。

ELISA的发展史:
1√ 目,分子生物学正在并肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而*的认识,其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的。

2√ ELISA测定技术的发展主要在于方法学的发展,而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。

3√ ELISA试剂盒它使我们对以一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举,并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。

新手实验注意事项:
新手以及那些没有固定协作供货商的顾客购买时往往有两种疑虑,要便是价格,其次,便是质量,国内试剂盒相关于进口试剂盒来说价格自然会低许多。

关于新手的视点来说价格低并不必定就会考虑购买,同时还在犹疑质量问题,由于没有用过新品牌的试剂盒心中总是在怀疑。

利用交叉实验即可辨别是否造假:小鼠ELISA检测试剂盒说明书
1、取出购买的试剂盒A的包被板两条。
2、一条包被板加试剂盒A的标准品做标准曲线。
3、另一条包被板加试剂盒B的标准品做标准曲线。
4、后续操作按照试剂盒说明书进行,加检测抗体、酶复合物和底物。

我司在科研域积累了丰富的经验,正是为了帮助中国的相关单位能够利用我司的经验与技术优势,为中国民众提供更安全,快捷的生命域。

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做ELISA标准曲线时需要重点注意的细节问题:
1、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度,并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度,即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内,包括上限和下限;而对于呈S型的标准曲线,尽量要使实验样品的浓度在中间坡度陡段,即曲线几乎成直线的范围内。
2、检测标准样品时,应按浓度递增顺序进行,以减少高浓度对低浓度的影响,提高准确性。
3、标准曲线的样品数一般为7个点,但至少要保证有5个点。
4、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动,但一般来说,相关系数R至少要大于0.98,对于有些实验,至少要0.99甚至是0.999。
5、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的,所以先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事,否则后面的实验结果无从谈起。
6、好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度,这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

操作步骤:

1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):

将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度(一般所需抗原包被量为每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体.(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)

2. 封闭酶标反应孔:

5%小牛血清置37℃封闭40min.封闭时将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中的气泡,封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.
洗涤方法:吸干孔内反应液,将洗涤液注满板孔,放置2min略作摇动,吸干孔内液,倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤次数3次

3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):

检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl.
将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.

4. 加入酶标抗体:

酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行. 37℃,30-60min之间.短于30min往往结果不稳定.每孔加100μl.洗涤同。

5. 加入底物液(现用现配):

TMB-过氧化氢尿素溶液,OPD-过氧化氢底物液系统次之.
底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分钟,加入终止液显色.

6. 终止反应:

每孔加入终止液50μl终止反应,于20min内测定实验结果.

7. 结果判断:

OPD显色后采用492nm波长,TMB反应产物检测需要450nm波长.检测时一定要行空白孔系统调零.用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示,当P/N大于2时作为抗体的效价.(数值的大小依具体检测要求而定.)

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原创作者：上海笃玛生物科技有限公司