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新技术来提高基因组单碱基定点突变的效率齐一生物
点击次数：210 发布时间：2017/2/28 13:57:38
单核苷酸点突变是作物许多重要农艺性状发生变异的遗传基础。单碱基的变异会导致氨基酸替换或蛋白质翻译终止, 使基因功能发生改变，从而有可能产生优良的等位基因与优异性状。传统诱变及单碱基突变筛选技术（如 TILLING）需要进行基因组规模的筛选，耗时、耗力且鉴定到的点突变数目和种类有限。基因组编辑技术，特别是基于 CRISPR/Cas9 系统的基因组编辑技术，可以在基因组靶向位点处产生 DNA 双链断裂（DSB），以人为提供的外源供体 DNA 为模板，通过同源重组（HR）介导的 DNA 修复途径来实现对目标基因的单碱基突变。然而，植物中同源重组效率目前非常低，很难以此实现高效的、稳定的单碱基突变。因此，植物育种和基因功能研究迫切需要新技术来提高基因组单碱基定点突变的效率，以实现基因功能与农艺性状的定向改良。
中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组致力于作物基因组编辑方法的研究和应用。在前期工作基础上，借鉴哺乳动物单碱基编辑方法，高彩霞研究组利用 Cas9 变体（nCas9-D10A）融合大鼠胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI），构成了高效的植物单碱基编辑系统 nCas9-PBE，成功地在三大重要农作物（小麦、水稻和玉米）基因组中实现高效、精确的单碱基定点突变。通过在原生质体中对报告基因 BFP 以及三种作物中五个内源基因七个位点突变结果的详细分析, 发现 nCas9-PBE 可实现对靶位点 DNA 的 C 至 T 替换，C 碱基脱氨化的窗口覆盖靶序列的 7 个核苷酸（距离 PAM 远端的第 3- 9 位）；其中单个 C 的替换效率为 0.39-7.07%，多个 C 的替换效率高达 12.48%。通过遗传转化，利用该体系获得了靶标区域单碱基替换的小麦、水稻和玉米突变植株，突变效率可达 43.48%。nCas9-PBE 技术无需在基因组的靶位点产生 DNA 双链断裂（DSB），也无需供体 DNA 的参与，具有简单、广适、高效的特点。nCas9-PBE 单碱基编辑系统成功建立和应用，为高效和大规模创制单碱基突变体提供了一个可靠方案，为作物遗传改良和新品种培育提供了重要技术支撑。
该研究成果于 2016 年 10 月 31 日投稿，经严格的同行评议，2017 年 2 月 5 日被正式接受，2017 年 2 月 27 日在线发表于 Nature Biotechnology 杂志 (doi:10.1038/nbt.3811)。高彩霞研究组的博士生宗媛和王延鹏为该论文的共同作者。该研究得到科技部，农业部，中科院以及国家自然基金委的资助。
原创作者：齐一生物科技（上海）有限公司
