荧光蛋白质印迹可以为已经很强大的蛋白质检测技术提供许多优势。二抗与荧光染料（如 Alexa Fluor ® ）偶联， 产生可使用数字成像仪检测的信号。该技术灵敏度高，可定量使用，无需剥离和重新探测即可在同印迹上进行多重检测。

与比色法和化学发光蛋白质印迹法样，荧光蛋白质印迹法使用抗原-抗体复合物来检测通过电泳分离后固定在印迹膜上的特定蛋白质。蛋白质的可视化是通过使用配备适当光源的成像系统激发荧光染料来实现的。荧光染料在其激发波长处吸收光，然后在其发射波长处释放光子，使分子返回其基电子态。然后由配备正确滤光片的数字成像仪检测荧光分子（荧光团）发出的光。

Jackson公司：与化学发光和比色检测相比，荧光蛋白质印迹具有许多优势。

Jackson公司：多重检测——在次印迹上检测多种蛋白质

荧光印迹使多重蛋白质印迹分析变得容易实现， 因为 可以在同个印迹上同时检测和区分多种蛋白质。针对在不同物种中产生的抗的染料偶联二抗可用于标记每种特定抗原 （蛋白质）具有其自身发射波长的染料——光谱特性。光谱上不同的染料被数字成像仪激发并以其特征波长发光，从而允许在同个印迹上检测到两种或三种不同的蛋白质（图 2）。这提供了优于化学发光和比色检测的优势，化学发光和比色检测在查看多个目标时需要剥离和重新探测印迹。荧光检测允许定量使用印迹，因为印迹上的蛋白质不受刺激性剥离化学品的干扰。另个好处是通过电泳分辨不好的蛋白质的可视化，因为不能很好地分离大小的蛋白质可以通过颜色来区分。

定量的

产生的信号量与存在的蛋白质量成正比。当与宽动态范围相结合时，可以定量使用优化的荧光蛋白质印迹，因为可以在同个印迹上检测低丰度和高丰度蛋白质而无需饱和检测。

Jackson公司：灵敏度和鲁棒性

Alexa Fluor ® 680 和 790（图 2）等远红和红外荧光染料偶联物由于低荧光猝灭、高消光系数和低背景自发荧光而提供更高的灵敏度。它们可用于高灵敏度、定量和凝胶内 Western 印迹以及 microWestern、细胞内和细胞内 Western 阵列以及其他需要亮染料的技术。由于良好的稳定性，印迹可能会被存档和重新成像。

Jackson公司：荧光斑点印迹

种非常简单和快速的免疫技术，可用于优化检测限和筛选大量样品是斑点印迹。当分析物的迁移已经被表征时，斑点印迹是种快速而简单的方法来筛选多个样品中是否存在感兴趣的蛋白质。网格系统的使用可以确定检测灵敏度，而无需在多个蛋白质印迹中转移的可变性。使用荧光染料可以在同印迹上确认样品中存在种或多种分析物。

注意：与化学发光蛋白质印迹法样，荧光印迹法需要优化以改善对背景噪声信号的检测。背景可能来自用于印迹的材料，因此选择不具有荧光特性的材料很重要。聚丙烯酰胺电泳凝胶和印迹膜（硝酸纤维素和 PVDF）可能具有荧光特性，可导致显着背景。使用检测仪器上可用的各种过滤器选项观察未染色的凝胶或膜，如果可能，选择在膜不自发荧光的区域发光的荧光染料。

低信号可能是由于低抗原（由于低蛋白表达、降解或印迹膜过度清洗），并且随后的荧光标记将低，即使二抗具有放大优势。信号也可以由于荧光猝灭而降低，如果荧光标记太高，信号会因 Förster 共振能量转移 (FRET) 而减弱。与化学发光印迹相比，数字成像仪可以有效优化检测条件，化学发光印迹需要反复曝光才能优化。

备注：

图1：间接荧光检测。A. 荧光染料偶联二抗可检测目的蛋白的抗。B. 光用于在其激发波长激发荧光偶联物。C. 激发的荧光染料在其发射波长处发射光，通过数字成像仪检测到该光，从而使感兴趣的蛋白质可视化。

图2：无需剥离和重新探测即可对多个蛋白质靶标进行多重检测。使用 Alexa Fluor ® 680 远红染料和 Alexa Fluor ® 790 红外染料对蛋白质印迹进行双重免疫荧光染色。小鼠 IgG 用 β-巯基乙醇和 SDS 还原和变性。重链和轻链通过 SDS-PAGE 分离，转移到硝酸纤维素上，并用 1:100,000 稀释的 Alexa Fluor® 790-山羊抗小鼠 IgG、Fcγ 亚类 1 特异性（min X Hu、Bov、Rb Sr Prot, 115-655-205)（绿色）检测 50 kDa 重链和 1:100,000 稀释的 Alexa Fluor®680-山羊抗小鼠 IgG，轻链特异性（min X Bov、Gt、Hrs、Hu、Rb、Rat、Shp Ig、115-625-174）（红色）检测 25 kDa 的轻链）。荧光在 LiCor Odyssey 成像仪中成像。

图 3：荧光点印迹。使用 Alexa Fluor ® 488 Goat anti-Rabbit IgG (H +L) 检测到 ChromPure Rabbit IgG ( H+L)。应用蛋白质后，使用 5% 牛血清白蛋白封闭膜。1曝光；过滤器 525; 蓝色LED模组灯；3×3 分箱。

表 1：根据您的数字成像仪的设置，从紫外到红外的荧光染料可能兼容用于荧光蛋白质印迹。对于多重检测，重要的是选择光谱不同且没有重叠光谱的染料。

Jackson公司注于亲和纯化的二抗和纯化免疫球蛋白研究，服务域覆盖各大学科研所和医院里的动物研究以及生物医学研究机构的科学家。艾美捷科技是Jackson公司的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

来源：https://www.amyjet.com/brand/jackson-china-distributor.shtml