标题胰酶分离提取，进口胎牛血清提取制备酶的经典方法

   进口胎牛血清提取制备酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。

   本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。

      1、胰蛋白酶原的提取与分离：称取1－1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏(或用高速组织匀浆机捣碎)加1－2倍体积以预冷却的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取(按1g组织相当于1ml体积计算，以此类推)。检查提取液中PH，若高于PH3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持PH2.5－3.0之间。在冷室5℃左右搅拌提取18－24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液，滤液呈乳白色，用约300mlpH2.5乙酸酸化水再提取残渣一次(时间约为1－2h)，合并滤液，此时滤液PH值较高，可用5M H2PO4溶液调整PH至2.5－3.0，放置 3－5h后，浑浊滤液冷却后，用玻璃漏斗进行自然过滤，滤液呈黄色透明液体，收集滤液，量其总体积，弃去沉淀物。

2、盐析：滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75％饱和度。盐析溶液放冷室中过夜，次日用4000r/min离心机离心，或用布氏漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，可得约20g胰蛋白酶原粗制品。

3、胰蛋白酶原得激活：将胰蛋白酶原粗制品用10倍体积得冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，溶液呈乳白色，量其体积，取出1ml溶液用于测定，溶液中硫酸铵得含量(约为滤饼重得1/4)。因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程，按浓度量计算，将已研细的固体CaCL2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀。用5MNaOH溶液调PH至8.0。在酶溶液加入约5mg结晶猪胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，置5℃冰箱中使酶原活化。

4、纯化：去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5M硫酸溶液调节滤液PH至2.5－3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，滤液体积约1000ml，加入已经研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40％饱和度(每升滤液加242g硫酸铵)。放置5℃冰箱中5－8h,抽滤除去沉淀。