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【摘要】采用紫外可见吸收光谱和荧光光谱研究了酶解小麦蛋白产物与还原糖不同加热条件下的美拉德反应及其产物。美拉德反应在紫外区240和294nm产生两个特征峰，荧光的最大激发和发射波长为347和450nm;随反应进行，紫外光吸收和荧光强度迅速增加，表明美拉德反应进入高级阶段，产生的糠醛类、呋喃酮类、吡喃酮类、噻吩类及噻唑类等小分子物质表现较大的积累速率。温度升高，强度增加速率增大。在较高温度时，紫外光吸收出现最大平稳值;荧光强度则到达最大值后降低，表明小分子物质间或与肽聚合生成大分子黑素类物质，小分子物质的积累表现消除速率，反应进入终级阶段。
【关键词】水解植物蛋白，美拉德反应，Strecker降解，紫外可见吸收光谱，荧光光谱
1引言
水解植物蛋白是指用酶、酸或碱水解大豆、小麦、玉米等植物蛋白得到的混合产物[1]。水解植物蛋白由于其价格低廉、质构功能性优良和较高的营养价值而被广泛应用于食品生产中。主要将其作为原料制备美拉德反应型香精料[1～3]或作为添加成分提升食品的感官和营养品质[4,5]。水解植物蛋白的这类应用是通过美拉德反应实现的。
利用水解植物蛋白制备香味的美拉德反应，主要是反应高级阶段糖降解和Strecker降解产生糠醛类、呋喃酮类、吡喃酮类、吡啶类、吡嗪类、噻吩类及噻唑类等挥发或半挥发性小分子气味物质[6];反应过程复杂，难于应用反应动力学对其进行设计和监控;反应产物种类繁多，已有的检测方法繁琐耗时[7]。因此，研究一种简单、快速、有效的美拉德反应程度监控方法，对于优化反应条件和控制生产是十分必要的。本研究以酶解小麦蛋白产物（wheatproteinenzymatichydrolysates，eWPH）为原料，设计了产生肉香味的美拉德反应，对不同温度时间组合下的美拉德反应进行了光谱学研究，以紫外可见吸光谱和荧光分析为指标，对反应程度和产物进行了表征和剖析。
2实验部分
2.1仪器、材料与试剂
UV2102PC紫外可见分光光度计（上海尤尼柯公司）;F2500荧光分光光度计（日本Hitachi公司）;Biofuge台式冷冻高速离心机（德国Heraeus公司）;螺口密封玻璃管（16mm×160mm，德国Schott公司）;DKU3恒温油槽（上海精宏公司）。小麦蛋白,蛋白质含量>70%（青岛中际华兴国际贸易有限公司提供）。L半胱氨酸、木糖和葡萄糖（生化试剂，含量>98.5%）;碱性蛋白酶、Flavourzyme风味酶和α淀粉酶为生化试剂。其它试剂均为分析纯。
2.2实验方法
2.2.1酶解小麦蛋白产物的制备取40g小麦蛋白配制10%（w/V）的悬浮液，调节pH至7.0，预热至50℃，加入碱性蛋白酶、Flavourzyme风味酶和α淀粉酶，酶与蛋白比例为0.5%，恒温搅拌，水解8h。水解结束后，升温至100℃，保持5min，灭酶活。冷却至室温，以4000r/min离心15min，上清液即为酶解产物。作3个水解平行样品，合并上清液并定容至1200mL。
2.2.2酶解小麦蛋白产物分析采用凯氏定氮法测定蛋白含量;3，5二硝基水杨酸比色法[8]测定还原糖含量;甲醛滴定法[9]测定水解度;高效液相色谱法[1]测定产物分子量分布。
2.2.3酶解小麦蛋白产物制备肉香味的美拉德反应设计文献[2]报道eWPH与还原糖和含硫化合物制备肉香味的美拉德反应参数主要是pH、温度、时间、还原糖和含硫物质种类和用量。本研究在文献[7,10]的基础上确定将5g木糖/葡萄糖和1.35gL半胱氨酸溶解于40mL小麦蛋白水解液中，用0.1mol/LHCl或0.5mol/LNaOH调节混合液pH5.5。样品在预定温度下加热一定时间后，取出，冰浴冷却。-40℃冻存12h，室温自然融解，12000r/min离心60min，除去反应产生的褐色不溶物质，上清液用于光谱分析。空白进行同样处理。
2.2.4美拉德反应紫外可见吸收光谱的测定取所有样品上清液稀释100倍。以空白样品为基线，用1cm石英比色皿于198～450nm波长范围内测定不同条件下美拉德反应的紫外可见吸收光谱。记录特征吸收峰的波长和强度。
2.2.5美拉德反应荧光分析取紫外可见吸收光谱的测试样液，参照文献[11]的方法，扫描确定eWPH与还原糖反应体系的最大激发（λex）和发射波长（λem），测定样品在此波长下的荧光强度。
3结果与讨论
3.1酶解小麦蛋白产物分析
采用2.2.2的方法，分析得到酶解小麦蛋白产物的蛋白质含量为75.5g/L;还原糖含量为0.91%;水解度为21.8%。分子量分布情况为：<1000Da（34.94%）;1000～5000Da（46.64%）;>5000Da（18.42%）。
复合酶水解法水解度高，产物澄清透明、低苦味，广泛用于蛋白质的水解中。本实验发现，碱性蛋白酶和风味酶复合对小麦蛋白的水解效果较好。小麦蛋白原料中除了蛋白质外，主要是淀粉，所以水解时添加了淀粉酶。酶解产物溶液中还原糖含量为0.91%，与蛋白质的比例约为1∶8。
3.2紫外可见吸收光谱的分析和反应产物剖析
美拉德反应通常可分为几个阶段[11]。初始阶段起始于羰基和氨基的缩合，生成Amadori/Heyns化合物;高级阶段主要是Amadori/Heyns化合物降解，释放氨基化合物，糖类物质通过烯醇化生成高反应活性的邻酮糖类（Oosones）[12]、糠醛类等物质;高反应活性的邻酮糖物质极易裂解生成酮类物质，酮类物质可进行醇醛缩合，或重新与氨基化合物反应，生成复杂的具有特征性风味的小分子物质;终级阶段主要是高级阶段产生的小分子物质自身或相互间聚合生成大分子褐色物质，使体系表现出显著的颜色特征。对于产生香味的美拉德反应，高级阶段的糖裂解和Strecker降解是至关重要的反应步骤。该过程产生的小分子物质是赋予特征风味的成分。vanBoekel等[6]构建了产生肉香味美拉德反应框架。实际上，美拉德反应是连续的瀑布式反应过程，生成的风味小分子物质可作为反应物进入终级阶段，使小分子物质的产生速率和积累量随热处理程度而变化。
研究确定小分子物质具有最大产生速率和产量的反应条件是有意义的。但是，美拉德小分子产物种类极其复杂，定量分析困难。文献[12]报道，美拉德反应的小分子产物具有强紫外光吸收和荧光，所以应用分光光度法表征小分子物质的产生速率和产量是一种简便、快速且低成本的新选择。美拉德反应主要影响因素是介质pH、加热温度、时间、还原糖和含硫物质种类和用量等。温度时间组合是最重要的参数，也是生产过程中的易调节因素。本实验采用分光光度法分析不同温度时间组合下eHWP与还原糖的美拉德反应程度和小分子产物情况。样品在预定温度（120，140和160℃）下加热一定时间（10，20，30和60min）。所有添加木糖的样品称为R系列，添加葡萄糖为G系列，添加无糖和L半胱氨酸的对照样品称为C系列。空白为3个系列的无加热样品。eHWP还原糖热处理后的紫外可见吸收光谱如图1所示，混合物加热后即在紫外区240和294nm产生两个特征吸收峰。
图2为3个温度下两个吸收峰强度随加热时间的变化曲线。与G和R系列相比，C系列的光吸收强度很小，表明这两个吸收峰主要是美拉德反应产生的。294nm光吸收是由糖裂解产生的酮、醛类等无色小分子物质产生的[14～16]。240nm吸收峰鲜有报道，一般认为具有共轭双键的物质在此波长下有特征光吸收。本研究体系中，240nm吸收峰可能是由于半胱氨酸受热脱硫生成氨基丙烯酸或Amadori化合物降解生成具有共轭双键的邻酮糖类[13]而产生的。美拉德反应高级阶段小分子产物具有强紫外吸收的特征已经被证明和应用，但物质种类复杂，目前尚未对其进行确认。
随着温度升高或加热时间延长，两个特征峰强度增加，表明美拉德反应产生的具有紫外吸收的呋喃酮类、吡喃酮类、吡咯类、噻吩类、吡啶类及吡嗪类等的小分子物质的积累。这些小分子物质是对肉香味有贡献的成分[7]。但是在较高温度时，两个峰强度出现最大稳定值，表明已生成的无色小分子物质之间或与肽等发生聚合反应，进入到终级阶段，生成褐色的大分子黑素类物质，从而使小分子的积累表现出一定的消除速率。当消除速率与生成速率平衡时，在紫外光吸收图谱上即表现为峰强度迟滞不变，甚至有所下降。对于产生香味的美拉德反应，这种使香味小分子消除的聚合反应是不期望的。
3.3荧光分析对小分子产物的表征
研究表明，美拉德体系中荧光强度与紫外光吸收强度的发展表现为不同的动力学行为[14～16]，所以荧光小分子物质被认为是不同于具有紫外光吸收物质的小分子产物。
eHWP与还原糖热处理后的荧光分析表明，本反应体系347nm激发的450nm的荧光光谱与其它美拉德反应体系[14，15]的结果相似。但不同于蛋白质因含有色氨酸残基而具有的荧光（λex=290nm，λem=336nm）[17]，所以体系的荧光是由美拉德反应引起的，荧光强度表征了高级阶段荧光小分子物质的产生状态。图3为不同温度时间组合下eHWP与还原糖混合物的荧光强度。C系列、G1和R1在60min的加热时间内荧光强度持续增加;G2，G3，R2和R3的荧光在加热一定时间时达到最大值，然后降低。表明美拉德反应进入终级阶段，小分子物质相互间或与肽等聚合成大分子褐色黑素类物质，使小分子物质的积累速率降低;荧光强度随时间延长而下降则是小分子物质的聚合消除速率大于生成速率，是产香美拉德反应所不期望的。
结合图2和图3，紫外可见光谱和荧光分析对美拉德反应程度的表征结果是一致的。120℃加热60min，140℃加热20min以及160℃加热10min期间，香味小分子物质具有较大的积累速率，是产生香味的美拉德反应较优的温度时间组合。
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