标题上海笃玛PAS染色试剂配制及染色方法说明

上海笃玛生物科技有限公司随着医学实验技术的发展，近年来，糖原染色应用的范围更加广泛，如用以证明与鉴别细胞内空泡状的性质，心肌病变及其他心血管疾病的诊断，糖原累积病诊断和研究，糖尿病的诊断和研究，用于某些肿瘤的诊断等。除用于糖原的鉴定和黏液的显示外，还可以观察肾小球基底膜、结肠杯状细胞中性黏液物质、阿米巴滋养体和霉菌的着色。临床诊断、分类和治疗提供了重要的依据。由于糖原的染色方法受取材组织是否新鲜、固定液的选用、染色时间是否适当、试剂的质量是否优质等限制较多，有必要对已有的实验方法进行总结和完善，以利于提高糖原染色的实用价值。

1材料与方法

实验材料新鲜小白鼠肝脏、肾脏标本各30例，均来自我室实验材料。

主要试剂

AAF固定液又称酒精醋酸福尔马林混合固定液，其配方：无水乙醇80mL，冰醋酸5mL、甲醛10mL。

Carnoy固定液 300mL，冰醋酸100mL，95％酒精600mL。

过碘酸溶液 0.5g过碘酸（HIO）溶于100mL蒸馏水或者70％酒精溶液中，或者按如下配方配制：过碘酸0.8g，95％乙醇70mL，醋酸钠0.27g，水20mL。待溶解后置于4~C冰箱避光保存。

无色品红液（Schiff氏液） 在三角烧内加入蒸馏水500mL，煮沸后，在保持微沸的情况下，加入碱性品红2.5g，并不断摇动约5min（勿使之沸腾），使碱性品红彻底溶解（溶解液为深红色）。冷却到50℃时，过滤，加入1N盐酸50mL，再待冷却至25℃时加入偏重亚硫酸钠2.5g，塞住瓶口，摇动容器以充分混合（此时颜色明显变淡），然后避光放置或冰箱内24h，溶液为淡黄或淡红色，再加入活性炭5g，混合后振荡数分钟，静置1h，再用双层滤纸过滤，此时溶液应完全无色、清澈透明，为无色品红。封口，贮存于棕色瓶中（最好外包黑纸避光）存放人4~C冰箱备用^[1]。

1N盐酸 浓盐酸（比重1.19含量22％）8.5mL加蒸水91.5mL或者98.3mL比重1.16盐酸，加入蒸馏水成1000mL。

偏重亚硫酸钠 1N盐酸7.5mL加10％偏重亚硫酸钠（钾）7.5mL，再加130mL蒸馏水混合而成。

笃玛生物染色方法

新鲜组织编号取材后，投入AAF液、Camoy固定液或者放人冰箱内低温固定。入无水酒精中脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋。常规切片厚5um，脱蜡至水；入0.5％一1％高碘酸氧化5—10min，环境温度以不高于20~C为宜，室温高时氧化时间适当缩短。流水冲洗5rain，再用蒸馏水浸洗2次；Schiff氏液（Schiff氏液从冰箱取出升至室温使用）避光染色l0—30min；0.5％偏重亚硫酸钠（钾）浸洗2次，每次1—2min，以达到分化的目的；流水冲洗5—10min，蒸馏水洗；Harris苏木精染2—5min，自来水洗；l％盐酸酒精分化，再用自来水充分冲洗；温水（或者1％氨水）返蓝，核染色稍浅为好；流水冲洗，常规脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。

2 结果

小鼠肝脏、肾脏各10例，选用无水酒精固定各5例，取材1h后固定，在环境温度20℃下，与高碘酸作用时间15min，组织染色均呈淡粉红色结果，无法区别PAS阳性物质，染色失败；选用AFF固定液和Carnoy固定液各5例，即时固定，在环境温度30℃下，与高碘酸作用时间30min，组织染色出现假阳性，染色失败；小鼠肝脏、肾脏各20例，选用AFF固定液固定各10例，选用Carnoy固定液各10例，即时固定，在环境温度20℃下，与高碘酸作用时间15min，染色结果：PAS阳性物质呈紫红色或红色颗粒，胞核呈浅蓝色，其他物质呈淡粉红色。表明新鲜组织取材后选择恰当的固定液及时固定，在环境温度不高于20℃下，染色作用时间少于20min条件下，PAS阳性物质呈紫红色或红色颗粒，胞核呈浅蓝色，其他物质呈淡粉红色。

3 笃玛生物讨论

过碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基变为乙二醛基。碱性品红中的醒式结构是碱性品红显色的原因，在碱性品红液中加入HCL使其酸化，再加入亚硫酸盐，导致碱性品红的醒式结构的双键被破坏，碱性品红被还原为无色品红，即Schiff试剂，此时溶液为无色透明液体。组织中氧化生成的醛基与Schiff试剂结合后即呈现出紫红色反应产物。颜色反应的深浅取决于组织内多糖的乙二醇分子的多寡。Schiff试剂在工作中使用数次以后即逐渐显出浅红色，染色强度也大大降低。作者在参考了他人的实验方法后^[1-4]，在试剂中加入一定量的亚硫酸氢钠或偏重亚硫酸钠（每100mL试剂加入0.2～0.5g），当染液恢复为无色透明液体后，染色效果与新配制的染液基本一致。

糖原染色在使用过程中需要注意以下几个方面：尽可能选取小块新鲜组织及时固定。糖原易溶于水，在酶的作用下很容易分解葡萄糖，更易溶于水，固定之前决不能用水或生理盐水等浸洗。应避免用水溶性固定液，宜采用酒精性固定液，如Carnoy液，能较好地保存糖原，但有使糖原流动到细胞一侧的现象，多数人认为是由于固定剂把细胞内的糖原推向固定剂对组织浸透的方向而造成。其他组织应用中性福尔马林固定为佳。组织在4℃左右温度内固定与保存，是针对糖的性质和避免糖原溶于水而采取的相应措施。乙醇能沉淀白蛋白、球蛋白，亦能核蛋白和糖原沉淀，但仍可溶于水，因此最好不单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂的混合固定液固定为佳^[3]。Schiff氏染液的配制是关键，尤其是偏重亚硫酸钠的质量，打开应是粉剂，且带有硫的气味，若成团或没有气味，则不能用，配制时使用的容器、药勺、称药天平与称药纸等必须洁净、无污染。新配制好的Schiff剂为无色透明液体^[1]，配好后可分成小份置于-20℃保存，用时取一份恢复到室温即可。沈洪武等通过对比染色发现，冷冻保存1年的Schiff液的染色结果与新鲜配制的染色结果一致^[5]。0.5％～1％高碘酸（pH值在3.0～5.0之间），环境温度以不高于20℃为宜，室温高时氧化时间适当缩短；如果染色时环境温度较高且高碘酸作用时间长，可使某些物质成分发生非特异反应，使染色结果出现假阳性。因此，室温较高时可适当缩短反应时间。PAS染色时需于暗处加盖反应，染色时间10～20min（染色时间长短取决于试剂的质量和环境温度，SO浓度高，染色时间适当缩短；环境温度高，染色时间也应适当缩短，反之则需适当延长反应时间）。染色过程中不能接触伊红，以免造成颜色误差^[4]。作糖原染色时，最好作消化对照，即取两张连续切片，其中一张脱蜡至水后，用1％淀粉酶于37℃消化30min，水洗后与不经消化处理的切片一起置0.5％高碘酸液氧化，如经消化处理的切片染色阴性，不经消化处理的切片染色阳性，即肯定为糖原^[6]。偏重亚硫酸钠（钾）溶液配置后，不能保存，因此，必须现配现用，用过一次即应废弃。各种试剂必须是化学纯或者分析纯。器皿、染色缸必须洁净而干燥。