标题等电聚焦电泳技术整理

试剂：

（1）单体交联剂：取丙烯酰胺结晶28.4g及双撑双丙烯酰胺1.6g，加蒸馏水至100ml；

（2）20%Ampholine，pH3-10；

（3）催化剂：取TEMED0.2ml，加蒸馏水至20ml；

（4）覆盖液：取20%AmpholinepH3-10 0.5ml及尿素3g，加水至10ml；

（5）0.02mol/L磷酸；

（6）0.01mol/L磷酸；

（7）固定液：12.5%三；

（8）其它试剂：同聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

操作

1.样品凝胶液的配制  总体积10ml，在小烧杯中由下列试剂混匀组成：?单体交联剂2.5ml（最终浓度7.5%）；‚20%AmpholinepH3-10 1.0ml；ƒ尿素5.7g；④蒸馏水加至9.5ml；⑤混合催化剂0.3ml；⑥血清（样品）0.2ml。

2.电泳柱的制备

（1）取12cm×0.4cm的玻管垂直插入橡皮泥中，用滴管将配制好的样品凝胶溶沿管壁注入至10cm高度。注意排除气泡。

（2）用注射器经针头沿管壁缓缓加一层覆盖液（约1cm厚），经光照催化聚合，约30min聚合完毕，吸去覆盖液，再加新覆盖液约1cm厚。

3.电泳

（1）将制备好的电泳分别插入电泳槽槽底的凝胶塞孔中，按管做好标记。

（2）电泳仪下槽中加入0.01mol/L磷酸，随后将带有电泳柱上槽盖上。用弯头滴管排除电泳柱底的气泡。

（3）用细滴管轻轻地在各电泳管中加满0.02mol/L NaOH，然后在上槽中加足0.02mol/L NaOH。

（4）将上电泳槽的电极接至电泳仪的负极，下电泳槽的电极接至电泳的正极。接通电源，通电开始时，调节电流为3-5mA/管，随着聚焦过程的完成，电流逐渐下降，约在半小时内接近零。再继续用250V通电2-3h，结束电泳。

（5）用水冲洗电泳管两端后，取下电泳管。用带有10cm长针头的注射器，沿管壁插入管内，边插边注入蒸馏水，使凝胶柱与管壁分开，再用洗耳球轻轻压出凝胶柱。

4.固定和染色

（1）将凝胶柱置试管或培养皿中，用固定液过夜。

（2）用考马斯亮蓝染色在60℃中脱色30-60min，至背景基本无色。

（3）换脱色液，在60℃中脱色30-60min，至背景基本无色。

（4）脱色完成后，保存于7%醋酸中。仔细观察血清蛋白质的色条数。

5.扫描 用光密度计在550nm波长下对凝胶柱进行扫描，观察曲线的形状及波峰。