标题干货分享|免疫组化、免疫印迹对比分享

免疫组化：

        融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原(多肽和蛋白质)进行定位、定性及相对定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。

免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），

       是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

实验目的

免疫组化 IHC / IF / ICC ——蛋白定位检测分析首选

定位较直接准确

定性灵敏度高

半定量（高质量染色，背景浅，特异性强的切片；表达量较多的蛋白）

免疫印迹试验 Western blot

测样品内蛋白含量，定量较IHC更准确

定性和间接定位，敏感性远远低于免疫组化技术

二：免疫组化、免疫印迹对比——实验（抗体）准备

实验准备-抗体

品牌选择：文献出处(biorbyt目前有1000个一抗在外文文献中引用)，试用装预实验

        biorbyt可以提供各种研究领域159052种不同货号的一抗，包括单抗/多抗，直标抗体，磷酸化抗体，病毒抗体；各种标记的二抗

biorbyt目前有1000多个抗体产品已在外文文献中引用

 以CD133 antibody orb99113为例

一抗:    

－－-抗体名称（蛋白全名，uniprot ID）

－－-实验类型（IHC, WB, FACS,ELISA）

－－-来源/种属（rabbit，mouse，rat, human, goat等）

－－-react with （human, mouse, rat, chicken,sheep, cow, pig,  guinea pig等）

－－-单抗（特异性高，亲和力弱，灵敏度低），多抗（特异性低，亲和力强，灵敏度高）

－－-分析样本中目的蛋白的结构性质（待测样本蛋白结构域，样品处理过程影响）

二抗               

－－-根据一抗种属来源而决定二抗来源

－－-标记物的选择。有HRP, Biotin, FITC,CY3, CY5, PE

直标一抗      

－－-适用于直接免疫实验（组化，荧光，流式，WB）特异性高，避免非特异染色，快速方便，敏感度低

－－-亲和性好的抗体才能进行抗体标记

抗体稳定性

－－纯度，高纯度，保障其的稳定性

－－浓度，高浓度减少容器表面吸附造成的物质损失，稳定性更好

抗体保存

－－避免反复冻融，分装保存在-20℃

－－复融抗体：如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来

－－抗体工作液：应该当天配制当天用完，4℃保存尽量不要超过1天

－－大部分抗体收到后4℃短暂保存1~2周对抗体活性没有影响

－－运输条件：一般的运输过程需要1~2周的时间，在低温4℃的条件下来完成的
  三：免疫组化、免疫印迹对比——实验（样本）准备

实验准备-免疫组化实验样本

 （新鲜，固定方式，充分脱水，防脱处理）

1.取材新鲜，及时固定：防止离体太久而发生组织自溶长菌，抗原扩散或丢失，易保存

2.固定液： 

（1）醛类：形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少；醛基与蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇不能充分暴露，需要抗原修复

- 4%多聚甲醛（常用，适用大多数组织，细胞）

- 10%福尔马林/甲醛（常用，脂肪类，脊髓类）

-戊二醛（微细结构保存好，用于电镜）

（2）醇类：穿透性强，脱水性强，易引起组织收缩，使蛋白变性作用轻，抗原可流失。

-乙醇，甲醇

（3）其他固定剂

-丙酮，抗原保存性好，脱色性更强，常用于部分细胞爬片

-混合固定剂，Bouni 液，Zamboni液，AAF液等

固定时间：醛类建议24小时以内，醇类，丙酮2小时以内，组织大小厚度略有差异

3. 充分脱水：保存时间长，防止裂片，保持组织结构，防止冰切形成冰晶

4. 防脱处理：防止掉片，多聚赖氨酸防脱切片，明胶和硫酸铬钾处理等

免疫组化切片类型

1.石蜡切片

易保存（干燥低温4~8℃保存），厚度3~6um，结构形态好，需要抗原修复，抗原活性偏低（烤片，固定等）

2.冰冻切片

不易保存（-80℃保存半年），厚度10~20um，形态结构较差，抗原活性高，不一定抗原修复，胞内核内抗原需打孔

冰冻切片是否需要抗原修复？如何固定？

（1）不能及时切片染色观察：可选择固定（24小时内）后切片，需要修复；或马上包埋切片后固定（10 min以内），可修复可不修复

（2）马上切片染色观察的，可不固定，可不修复

3.细胞爬片（贴壁，半贴壁，悬浮）

单层细胞，均匀爬片，选择合适的固定方式保证细胞形态，细胞周期同一化，不需要修复

－－-培养皿/平板                               －－-盖玻片爬片

实验准备-WB实验样本

新鲜制备，低温 裂解 （全蛋白，不包括核抽提、亚细胞器分离等）

裂解液，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂

研磨（组织），液氮（小体积组织），超声波（细菌/细胞）

跑胶，蛋白定量

Notice：

防止蛋白降解，磷酸化蛋白防止去磷酸化

浓度低蛋白量少不易检测，浓度高裂解液粘稠不易吸取

分泌型蛋白，无血清细胞培养收集上清，TCA沉淀富集

四：免疫组化、免疫印迹对比——实验方案

实验方案-免疫组化 IHC-P

脱蜡和水化，时间由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定

抗原修复，修复强度：高压修复>微波修复>胰酶修复；修复液多种，EDTA>柠檬酸；85~95℃处理约15min，自然冷却至室温

细胞通透，TritonX-100, >10 um厚切片

灭活内源性过氧化物酶和生物素，3% H2O2 10~12min

血清封闭，小牛血清、BSA、羊血清, 不能与一抗来源一致

抗体孵育，浓度*重要，温度决定反应速度，时间决定反应量

－－- 4℃过夜（16~24h），次日37 ℃复温 30 min，反应温和，背景浅

－－- 37 ℃ （1-2 h），反应速度快，时间短

－－- 室温，无法保证每次环境温度控制在一定范围，不建议

抗体稀释液（PBS, 专用的, PH7.4）

切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗，普通5 min*3 ，抗体10min*4）

DAB显色，由显微镜下控制显色时间，决定背景的深浅和特异性染色的深浅

复染，目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，胞浆蛋白适当时间长一点，核蛋白则要短。

长期保存，高倍镜观察，需脱水透化

封片，中性树胶等封片，避免产生气泡

免疫荧光注意避光，防止荧光衰减淬灭，防止自发荧光现象

双标免疫荧光实验设计

2个间标抗体，需要不同host，不同的荧光标记物

2个直标抗体，可以同host，不同的荧光标记物

1个间标抗体+1个直标抗体，不同host，不同荧光标记物，两抗体可共同孵育

1个间标抗体+1个直标抗体，同host，不同荧光标记物，需先孵育间标+二抗，后再孵育直标

实验方案-Western blot

  跑胶，分离胶浓度，转膜条件

  膜的选择  0.45/0.22

  －－- NC，操作简单，强结合力，背景低，信噪比高，脆易卷，经不起多度洗涤，适用多种显色

 －－-PVDF，蛋白截留力（强6倍）、机械强度、化学耐受性更强，不适用荧光，预处理

  监测转膜

  封闭，5%脱脂奶粉/血清封闭（4℃过夜，或37℃ 摇床1~2 hour）

  抗体孵育（4℃过夜，或37℃ 摇床 1~2 hour）

  抗体稀释液

  洗膜 （3~4次，7~10min/次）

  曝光

免疫组化结果常见问题分析

结果阴性的原因

1. 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误； 

2. 抗原修复不全，换修复液或加强修复；

3. 组织切片本身这种抗原含量低，设阳性对照片；

4. 血清封闭时间过长；DAB 孵育时间过短；

6. 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

非特异性染色的原因（着色一片黄/背景深）

1. 抗体孵育时间过长，抗体浓度；

2. 多抗易出现非特异性，可选择单抗；

3. 内源性过氧化物酶和生物素灭活不够；

4. 非特异性组分与抗体结合，延长血清封闭时间；

5. DAB 孵育时间过长或浓度过高；

6. PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；

7. 标本染色过程中经常出现干片；

8. 脱蜡不充分；

9. 二抗与标本的内源性组织蛋白有交叉反应。

染色弱阳性

1. 固定方式不当或固定时温度过高，影响到抗原的数量和质量；

2. 不适当的抗原修复方式，抗原决定簇暴露不足；

3. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间不足；

4. 孵育抗体前切片上遗留了过多的冲洗液；

5. 孵育时切片未放置水平，导致抗体孵育不均匀。

信号定位与预测不符的原因

1. 组织固定不及时，抗原扩散移位；

2. 抗体选择错误；
3. 膜蛋白核质染色：抗原修复过长，导致细胞膜破坏，膜蛋白转移。

WB结果常见问题分析

1. 无条带：抗体用错，转膜出错，抗原无表达，试剂失效等；

2. 细微弱带：上样量少，抗体浓度低，ECL发光液失效等；

3. 高背景：封闭不够，一抗浓度高，洗膜不充分；

4. 非特异性条带：抗体特异性差，也可能样品量大，抗体浓度高；

5. 条带出现边缘规则的白圈：转膜时膜和胶之间有气泡；

6. 条带中间出现白色：高浓度HRP把底物消耗过快后不发光；

7. 膜上很多黑点：膜上杂质与抗体非特异结合，洗膜充分，封闭液混匀；

8. 条带拖尾：蛋白裂解不好，蛋白量大，抗体孵育时间长，浓度高等；

9. 出现非均一性背景：洗抗体和发光时膜出现风干情况；

10. 条带弯曲不平整：胶配置不均匀，胶中有气泡杂质，玻璃板没洗干净，电流不均一等；

11. 条带蛋白分子量偏高/偏低：分离胶浓度选择不恰当，蛋白质降解；

12. 所有条带练成片：上样量大或电泳中途停止过长，样品弥散。

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