标题实验记录：原代脑微血管内皮细胞（BMEC）分离步骤

       看到好多宝宝关于原代提取中都有疑问，这个是我们实验员在做原代脑微血管内皮细胞（BMEC）时，我们这边做的一个实验记录及分离步骤，仅仅供大家参考。

一、实验材料：

SD 大鼠（4～6 周龄，雄性），大号手术剪，镊子，50 ml 离心管，6 孔板，75% 乙醇，生理盐水，胶原酶，25% BSA，多聚赖氨酸，DMEM/F12 基础培养基，DMEM/F12 完全培养基

二、实验仪器：

超净工作台，低速离心机，二氧化碳培养箱

三、实验步骤：

1. 将大鼠对大鼠实行 anlesi，浸泡在 75% 乙醇中约 1 min
2. 剪开头部皮肤，快速取出大脑，尽量保证完整性
3. 将大脑放入预冷的 DMEM/F12 基础培养基中
4. 在超净工作台中，去掉外层血痂，脑膜，外层血管（平皿上操作）
5. 去掉白质（松散状），保留灰质（贝壳状的左右脑）。
6. 4 ℃ 预冷培养基多次清洗
7. 将大脑剪成 1 mm3 的块状，转移至无菌的 50 ml 离心管中，将块状大脑剪碎，移液枪吹打。
8. 900 rpm 室温离心 4 min，弃去上清，然后添加 5 ml DMEM/F12 无血清培养基用移液枪吹打均匀，然后补加 10 ml 培养基，加 100 μL 胶原酶Ⅱ，37 ℃ 消化 30～45 min，同时用 1 ml 多聚赖氨酸包被 6 孔板。

消化完成后加入培养基中和，900 rpm 室温离心 10 min。

直接加入 15 ml 25% BAS，2 000 rpm 室温离心 20 min。离心后离心管出现分层，下层深红色（少量）为脑微血管细胞。

生理盐水轻轻冲洗 6 孔板中多余的多聚赖氨酸，冲洗 2 次。

取下层脑微血管沉淀，加入生理盐水混匀，900 rpm 室温离心 5 min。用新鲜 DMEM/F12 完全培养基将细胞重悬，重悬后转移至 6 孔板中培养。