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标题定量PCR常见问题(二)

   

提供者:长沙骏逸实验仪器有限公司    发布时间:2008/9/16   阅读次数:647次 >>进入该公司展台
8.      什么是背景校正?多长时间执行一次背景校正?
    背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间,定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度,信号收集的温度为60 °C。随后,SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值,提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件,从实验数据中扣除背景信号。
    因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素(比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等)而变化,所以推荐定期进行背景校正,一般每三个月到半年校正一次。
9.      什么是纯荧光校正?多长时间校正一次?
    纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度,通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后每次定量实验运行过程中,SDS软件收集样品的原始光谱信号,并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较,精确扣除不同染料的信号重叠部分,从而确定样品中的荧光染料种类和信号强度。
    推荐每隔半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前,请先进行背景校正和ROI校正。
10.96孔板怎样封膜?
    当使用96孔板做实验的时候,推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是:先沿着96孔板的纵向压膜,然后横向,最后沿着板的边缘按压使之密封。具体手法见下面图示:
11.使用单管或8连管做实验时,在样品加热块上应该怎样安排放置?
    使用单管或8连管做实验,并且样本数量不多的时候,建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品,最好是纵向放置,并且优先放在第6列或第7列,然后逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜,各个反应管的受力和受热都比较均匀,提高孔与孔之间的数据精密性。
12.绝对定量与相对定量有什么区别?
    绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说,如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本,通常可以将未经处理的样本指定为基准,规定其目的基因浓度为100%,将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果,就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。
    绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线。
     相对定量实验有两种方法:标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法,可以使用绝对标准品,也可以使用相对标准品,而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品,典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。
    CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系,来计算不同样本之间的相对百分比,其计算公式是
    
    绝对定量的数据易于理解,但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购,可以解决这种困难。相对定量的标准品容易在实验室里自己制备,但是数据处理比较麻烦,对实验数据的解释有一定难度。
13.定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理?
    总的来说,有三个层次的校正是必须要做的。
    首先,参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX,这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除,使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度,提高重复管之间的数据重现性。
    其次,内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的,但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞,所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因(如IL-2)的同时定量一个内对照基因(如18S RNA基因),然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。
    第三,计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别,则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。
14.标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理?
    假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化,所用的内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数,数据的处理方法见下表:
15.什么是CT值比较法?数据怎么处理?
    CT值与起始DNA浓度的对数成反比:
   如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同;(2)这些PCR的反应效率接近100%,可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT
    假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化,所用内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是CT值,而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。数据的处理方法见下表:
16.每个反应管中可以加入多少种探针?
    每个反应管中可以加入的探针数目,取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。
    首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下,全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制的。如果信号的采集要通过滤色片,那么探针的数量取决于滤色片的数目,增加探针需要增加或改变滤色片。改动仪器的结构通常很困难。以AB公司的仪器为例,7900和7700是激光-全波长检测的,7000、7300是4色滤色片的,7500是5色滤色片的。
    其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起,在同一反应管内使用,必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近,既保证信号激发的效率又保证信号不重叠干扰,能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限,满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。
    第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光,占去一种荧光;TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光,对于4色检测的仪器来说,只剩下2种荧光可以标记探针,对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqMan MGB探针,由于它的淬灭基团是不发荧光的,比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高,不做ROX校正(AB公司不推荐这样做),还可以再多一种荧光用于标记探针。
    第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变,因为绝大多数人类基因是2态的,只存在两种等位基因,2条探针已经足够。如果研究基因表达,通常是两两比较居多,比如处理比未处理,正常比异常等,加上一个内对照,3色也就足够了。
    最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度,二是节省反应成本。同时测定的基因越多,成本也越低。但是加入4-5种探针,就要同时加入8-10条引物。在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰,平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的,但是要花费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大,在总体上可能反而不合算。
    在实际应用中,不是单纯追求加入的探针越多越好,而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应,引物和探针的设计不太困难,反应条件的优化也不太麻烦,同时降低了成本。
17.等位基因鉴定实验(比如SNP分型)是定性的研究,是否可以不进行ROX荧光校正?
    不,等位基因鉴定实验也要进行ROX荧光归一,以保证实验结果的精密可靠。
    由于试剂加样操作的误差、离心管热量传递的误差、离心管盖透光性能的误差等偶然因素是不可避免的,必然导致荧光激发效率的差异,因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正,相互之间才可以比较并保证重现性。
    这种校正是通过在反应缓冲液中添加ROX校正荧光来实现的。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的,因此其信号的高低变化只与上述物理方面变化的总体效应有关。将报告荧光的信号除以ROX荧光的信号,就能够消除所有这些物理因素所引起的数据波动。
18.内标法和外标法哪种数据更精密?
    是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致,缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制,导致它们的PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会,但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大,也会导致它们的PCR效率有差异。两相比较,内标法与外标法的数据精确度是一样的。
 

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关键词:定量PCR  离心机  高速离心机  

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