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组织细胞甘油含量试剂盒说明书下载
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文件大小：23kb
上传时间：2017/9/5 10:31:06
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上 传 者：齐一生物科技（上海）有限公司
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组织细胞甘油含量酶法测定试剂盒
描述：甘油是甘油三酯的水解产物。与游离脂肪酸
一样，甘油含量是甘油三酯水解反应的可靠检测指
标，但检测更加方便。本试剂盒采用优化步骤，能
够检测实体组织、细胞中的甘油含量，线性范围为
10-1200µmol/L。
原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化为 3-
磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化
氢；在过氧化物酶作用下生色底物转化为苯醌亚
胺，其光密度值与甘油浓度成正比。
适用范围：测定实体组织、细胞中的甘油浓度。
组成 (105次微板测定或30 次 1 ml比色杯测定)：
(1) 裂解液 50 ml
(2) R1试剂 16 ml
(3) R2试剂 4 ml
(4) 4 mmol/L甘油标准品1 ml
4 ºC，储存3月。
所需设备：酶标仪、生化分析仪或 721、722型可
见光分光光度计。*佳工作波长 550nm，如无此波
长建议优先选用 570nm、次选 530、490nm。
一 组织细胞裂解
细胞(包括分化的脂肪细胞)裂解：
消化、离心收集细胞。或直接在培养皿内裂解。
通常6孔板单孔约2x106
个细胞， 75cm2
瓶约1x107
细胞。按比例每1~2 x 106
细胞加0.1ml裂解液，
混匀，静置10分钟。
动物组织裂解：
切记要预先将新鲜组织剪切称重后再进行保存。
组织冻存后再进行解冻、剪切、称重可能会产生
严重的测量误差。离心管精确称重，加入组织块
后再称重，二者相减(即减量称重法)计算组织重
量(约 100mg)。强烈建议按比例每 1mg 组织加
10µl裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而
产生的误差。（注意；裂解液用量在 1ml 或更多
可保证有效的裂解与脂质提取）。用电动高速匀浆
器或手动玻璃匀浆器破碎组织。（不推荐超声方
法，因其不能完全和均匀破碎。应根据预实验调
整初始的组织细胞加入量），而后，静置10分钟。
二. 裂解液处理：
1. 取适量上清液转移到1.5ml离心管中， 进行步骤
2 的操作。余下的裂解液可用 BCA 法蛋白定量
试剂盒(#P1511)进行蛋白定量或－20ºC 储存。
2. 70ºC 加热10 分钟灭活脂肪酶，可能出现絮状沉
淀。
3. 室温 5000rpm 离心 5 分钟，上层清液即可用于
酶学测定。
三 工作溶液配制：按4:1比例，取4 ml试剂R1与
1 ml试剂R2混合即可， 立即使用或4ºC保存<1天，
变色弃去。 （注意：谨防来源不明但容易发生的甘
油污染，可来自操作者本人或标准品液体微粒溅射
等。）
四 标准品稀释：用蒸馏水、生理盐水或与样品缓
冲液一致的液体，将4 mM 甘油标准品倍比稀释为
1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125
µmol/L，通常取其中4~6管即可，注意设置0 浓度
对照反应管。
五 甘油测定
1. 参见下表加样。待测样品体积 10µl，多加可能
会抑制反应。
2. 37ºC 或 25ºC 反应 10 分钟。反应平衡后颜色在
60分钟内稳定。
3. 先用蒸馏水+工作液的空白管调零，然后测定各
管OD值。
4. 绘制标准曲线并计算甘油浓度。
附Excel作图步骤：各标准管OD 值为 y轴，标
准品浓度为 x 轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击
做图向导，选择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠
标右键点图上的某一点，点击-添加趋势线-，点
击-选项-，点击-显示公式-和-R2
值-。
5. 以每mg 蛋白浓度或细胞数校正甘油含量。
加样表
96孔微板测定 1 ml比色杯测定
空白管
标准品
样品 空白管
标准品
样品
蒸馏水µl 10 35
标准品µl 10 35
样品µl 10 35
工作液µl 190 190 190 665 665 665
说明：
1. 维生素C>0.18g/L、 血红蛋白>2g/L、胆红素>0.25g/L、
二硫苏糖醇、巯基乙醇、高浓度EDTA干扰测试。
2. 红细胞糖酵解时合成磷酸甘油影响测定。
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