标题展青霉素酶联试剂盒说明书

1．概述

展青霉素酶联免疫反应测试盒是利用竞争性的酶联反应原理，用于饲料、蜂蜜、肉类（牛肉、鸡肉和猪肉）、鱼虾、牛奶、组织、血清和尿液中展青霉素残留的定量检测。

该试剂盒具有以下特点：

Ø 快速，高回收率（75-95%），多种样品的低成本提取方法。

Ø 高灵敏度（0.1ng/g或ppb），低检测下限（牛奶0.5ng/g或ppb）。

Ø 高重复性。

Ø 检测过程只需要不到1.5小时。

2．试剂盒原理

展青霉素酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，含有展青霉素的抗体已经包被于微孔板上。药物分析时，样品同酶标抗原被添加到板孔中。如果样品中含有药物，会竞争抗体，抑制抗体与酶标抗原结合。加入底物后，产物的颜色强弱与样品中药物的浓度成反比。

3．试剂盒组成

本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。如果超过1个月不使用试剂盒，请

将展青霉素HRP酶标记物 放置-20℃或者冰冻保存。

4．检测限

5．交叉反应

6．未提供的设备或材料

1） 酶标仪

2） 恒温培养箱

3） 移液器（10、20和100mL，1mL各一支）

4） 漩涡振荡器

5） 匀质器

6） 多道移液器（50-300mL）

7．注意事项

实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。

1） 标准品中含有展青霉素，请小心使用。

2） 不要使用过期的试剂盒。

3） 不同批次的试剂盒不要混用，酶标记物和微孔板具有盒与批次的特异性。确保其正确使用。

4） 尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。

5） 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。

6） 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。

7） 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。

8） 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。

9） 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。

8．试剂的准备

所有的试剂在使用之前应将其回温至室温，并在使用试剂前摇动几下，以保证合理的浓度。

（1）1×样品提取液

按1：9的比例配制10×样品提取液和蒸馏水。

（2）35%的（甲醇）/（样品提取液）溶液

按6.5：3.5的比例配制1×样品提取液和100%的甲醇。

9．样品的准备

（样品在使用前请保存在2-4°C下）

饲料

（1） 取一定量的样品，添加5倍的70%的甲醇（如：1g样品中加入5mL的70%的甲醇），漩涡振荡混匀；

（2） 取1.5mL匀质样品，室温下4000g离心5分钟。

（3） 取0.5ml 上清液，加入0.5ml 1x 样品提取液，混匀。

（4） 每孔取100μl用于检测。

稀释倍数：10

 蜂蜜

（1） 称取0.1g蜂蜜样品，加入1.9ml的35%乙醇/样品提取液，混匀

（2） 每孔取100ul用于检测。

稀释倍数：20

肉类/肝脏/肾脏/鱼/虾

（1） 取1g 匀质去脂肪样品，加入4ml 70% 甲醇。

（2） 最大转速涡流震荡10分钟。

（3） 室温下4000g 离心5分钟。

（4） 取0.5ml 上清液，加入0.5ml 1x 样品提取液，混匀。

（5） 每孔取100μl用于检测。

稀释倍数：10

牛奶

（1） 有脂肪的奶粉，取1ml牛奶，4000g离心5分钟，去除上层脂肪。（脱脂奶粉省略这一步）

（2） 取200μl牛奶样品，加入800μl 35% 甲醇/样品提取液，混匀。

（3） 每孔取100μl 用于检测。

稀释倍数： 5

血清/尿液

（1） 取0.5mL 样品，在4000g离心5分钟；

（2） 取,0.2 mL上清液，加入0.8mL 35% 甲醇/样品提取液，混匀。

（3） 每孔取100μl 进行检测。

稀释倍数：5

10．酶联免疫反应测试步骤

所有试剂使用前回到室温，试验中用到的试剂现用现配，多余的试剂不能倒回原先的瓶子里，避免试剂的交叉污染。

1×工作洗液

按1：19的比例配制浓缩洗液和双蒸馏水。

检测

以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。

（1） 加入100mL的标准液或样品于所设定的孔中；

（2） 每孔加入50mL 酶标（避免阳光直射和工作台温度过低，孵育时适当覆盖微孔板）；

（3） 室温（20-25℃）孵育60分钟；

（4） 洗板3次，每次应该加入250mL，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；

（5） 加入100mL的TMB底物（底物本身是无色的，出现颜色变化不能使用。孵育时适当覆盖微孔板）；

（6） 加入底物后立即计时，轻敲试剂盒使混匀；

（7） 在室温下培养15分钟，加入100mL的终止液终止反应，在450nm下读OD值（读数前用无绒布擦拭微孔底部水分和指模）。

11．结果计算

（1）分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。

相对吸光度值 （%） =（标准或样品吸光度值/零标准吸光度值） ´ 100

（2）以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。

（3）从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。

  备注：如结果呈阳性反应，应该用其他检验方法（如色谱/质谱方法等）进行确证。

以下曲线图是展青霉素酶联免疫反应测试盒典型标准曲线