For Research Use Only
仅供研究用
货号：QYS-236090
乙酸激酶（acetate kinase，ACK）试剂盒说明书
分光光度法 50 管/48 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：
ACK 主要存在于微生物中，催化乙酸和 ATP 生成乙酰磷酸和 ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。
乙酸激酶（acetate kinase，ACK）试剂盒说明书测定原理：
（1）ACK 催化乙酸钠和 ATP 生成乙酰磷酸和 ADP，（2）丙酮酸激酶催化 ADP 和 PEP 生成 ATP 和丙酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD+，（4）在 340nm 下测定 NADH 氧化生成 NAD+速率，即可反映 ACK 活性。
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制：
提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；试剂一：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前每瓶加入 4mL 蒸馏水，充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存；
试剂三：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 4mL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂仍-20℃保存；
试剂四：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 2.5mL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂仍-20℃保存；
试剂五：粉剂×2 支，-20℃保存；临用前每支加入 1mL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂六：液体 800μL×2 支，4℃保存；临用前每支加入 720uL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存；
试剂七：粉剂×2 支，-20℃保存；临用前每支加入 800uL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存；
试剂八：粉剂×2 瓶，4℃保存；临用前每瓶加入 4mL 蒸馏水，充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存。
样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
乙酸激酶（acetate kinase，ACK）试剂盒说明书测定步骤：
试剂测定管
试剂一（μL）855
试剂二（μL）45
试剂三（μL）150
试剂四（μL）90
试剂五（μL）30
试剂六（μL）30
试剂七（μL）30
试剂八（μL）150
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min
样本（μL）150
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1 和 3 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。
注意：若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四、五、六、七和八按比例配成混合液，在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min 以上，测定时加入 1380µL 混合液和 150µL 样本测定。
ACK 活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样×Cpr） ÷T=547×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
ACK（nmol/min /g 鲜重）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W× V 样÷V 样总） ÷T=547×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
ACK（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总） ÷T=1.094×ΔA V 反总：反应体系总体积，1.53×10-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：
比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.15 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
