标题总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒说明书

550nm的分光光度计、37℃恒温水浴或气浴箱、台式离心机、漩涡混匀器、微量移液器、双蒸水、冰醋酸（分析纯，乙酸浓度≥99%.5）

二、适用范围：

本试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶 （SOD） 活力。可测血清（浆）、脑脊液、胸水、腹水、肾透析液、尿液、精液、红细胞、白细胞、血小板、心肌培养细胞、肿瘤培养细胞、各种动植物细胞、及亚细胞水平（线粒体、微粒体）中的 SOD 活力，并可检测微生物、药物、食品、饮料、化妆品中的SOD 活力。

 总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒说明书三、试剂的组成

试剂一：贮备液，10ml×1 瓶，4℃保存。（天冷时或放冰箱有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）用时每瓶10ml贮备液加双蒸水稀释至100ml，4℃保存一年。

试剂二：液体10ml×1 瓶，4℃保存一年。

试剂三：液体10ml×1 瓶，4℃保存一年。

试剂四：贮备液，350μ 1×2支，-20℃保存；

        4号稀释液10ml×1 瓶，4℃保存6个月。

试剂四应用液的配制：用时按贮备液：稀释液=1:14比例配制，用多少配多少，4℃保存，不可冷冻。

注：所用吸嘴为一次性吸嘴。

试剂五：粉剂×1支，用时加70℃-80℃热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用双蒸水补充支75ml，配好后的试剂避光4℃冷藏一年。

试剂六：粉剂×1支，用时加双蒸水75ml溶解后备用，配好后试剂避光4℃冷藏保存6个月。

显色剂的配制：按试剂五：试剂六：冰乙酸=3:3:2的体积比配显色剂，用多少配多少，配好的显色剂4℃避光冷藏3个月

注：

冰醋酸（分析纯，乙酸浓度≥99%..5）

试剂五，试剂六必须分开进行配制（切不可将试剂五，试剂六混合后再进行配制）否则不显示。

  总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒说明书

四、样本处理

1.收集血清、血浆所用离心转速：

   分离血清或血浆，根据种属不同，离心转速也有差异,推荐离心转速为:

    ①、小鼠：一般1000-1500转/分，离心8-10分钟；

②、大鼠、兔子：一般2000-2500转/分，离心8-10分钟；

③、人：一般2500-3000转/分，离心8-10分钟。

2.动物组织匀浆的制备

1、取组织块（0.1g～0.2g）最少可到2～5mg在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入5ml的匀浆管中。

2、按重量（g）:体积（ml）=1:9的比例加入9倍体积的匀浆介质（pH7.4， 0.01mol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA-2Na ,0.01mol/L蔗糖,0.8%的氯化钠溶液）或者0.86%的生理盐水于匀浆管中，冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块。

3、匀浆的方式有多种：手工匀浆，机器匀浆，超声粉碎。

① 手工匀浆：左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，制成10%的匀浆液。

② 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000 转/分 上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

③ 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用400安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

        镜检观察:取少量组织匀浆作涂片（直接涂片、染色均可以），显微镜下观察细胞是否破碎，若没有则可延长匀浆时间。

4、将制备好的10%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机2500转/分左右,离心10～15分钟，取上清液进行测定.

3.植物组织匀浆的制备

1、取组织块（0.2g～0.5g）最少可到5～10mg在冰冷的PBS中漂洗，滤纸拭干，准确称重，放入5ml的匀浆管中。

2、按重量（g）:体积（ml）=1:4的比例加入4倍体积的匀浆介质于匀浆管中，冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块。

3、匀浆的方式：手工匀浆，机器匀浆。

① 手工匀浆：左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，制成20%的匀浆液。

② 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000 转/分 上下研磨制成20%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行,可适当延长匀浆时间），

镜检观察:取少量组织匀浆作涂片（直接涂片、染色均可以），显微镜下观察细胞是否破碎，若没有则可延长匀浆时间。

4、将制备好的20%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机4000转/分左右,离心10～15分钟，取上清液进行测定.

五、操作表：

  总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒说明书

总SOD（T-SOD）活力的测定

混匀，室温放置 10 分钟，于波长 550nm 处，1cm 光径比色杯，蒸馏水调零，比色。

注：a*代表样本取样量和双蒸水取样量；

六、计算公式：

1、血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD 活力计算：

定义：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）

计算公式

2.动物组织匀浆中总SOD 活力计算：

定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%是所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

计算公式

*mgprot为毫克蛋白数

3.植物组织匀浆中总SOD活力计算：

方法一（根据组织匀浆浓度进行换算）

定义：每毫克组织在1ml反应液中SOD抑制率达50%是所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

计算公式

方法二（根据蛋白浓度进行换算）

定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%是所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

计算公式

*mgprot为毫克蛋白数

注：第一次使用本试剂盒测定前，选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定，以确定最佳取样量。